圖1 實驗流程圖

①通過UPLC-MS/MS獲得靈芝孢子粉的化學信息，并用質譜分子網絡對數據進行快速解析；

②通過中性粒細胞或巨噬細胞缺陷斑馬魚模型，以中性粒細胞數量、巨噬細胞數量及巨噬細胞吞噬活性三個方面來評價其免疫調節活性；

③根據靈芝孢子粉樣品中各成分的峰面積及相應的藥效，通過偏最小二乘回歸（PLSR）算法計算各成分的免疫活性并排序，篩選出潛在的免疫活性成分。

? 靈芝孢子粉（GLS）

? 破壁靈芝孢子粉（BGLS）

? 去壁靈芝孢子粉（RGLS）

圖2 典型色譜圖（A）；基于分子網絡的靈芝三萜類成分快速解析圖（B）

實驗數據顯示：

1、分別從靈芝孢子粉、破壁靈芝孢子粉和去壁靈芝孢子粉中鑒定出20、96、109種三萜類化合物。說明去壁之后三萜類化合物的種類也提高了。

2、以峰面積為指標，發現去壁靈芝孢子粉單個三萜化合物的含量比破壁靈芝孢子粉提高2倍以上，最高提高超16倍。

這說明去壁工藝可以富集靈芝孢子粉的有效成分，顯著提高其含量。

構建斑馬魚中性粒細胞、巨噬細胞缺陷模型。

圖3  破壁、去壁靈芝孢子粉對中性粒細胞及巨噬細胞減少癥的藥效作用

實驗數據顯示：

1、不同濃度的破壁和去壁靈芝孢子粉作用后，斑馬魚中性粒細胞數量有不同程度的恢復，其中33 μg/mL的去壁孢子粉可以極顯著促進中性粒細胞的生成數量，效果也優于破壁孢子粉；

2、高濃度的去壁靈芝孢子粉（333、1000 μg/mL）可顯著促進巨噬細胞的形成，并增強其吞噬功能，而破壁孢子粉的作用沒有顯著性。

這說明去壁靈芝孢子粉的作用要優于破壁靈芝孢子粉。

圖4 基于偏最小二乘回歸（PLSR）的靈芝孢子粉免疫活性成分分析

實驗數據顯示：

以上結果提示靈芝孢子粉的免疫調節活性與有效成分三萜含量呈正相關。本研究使用偏最小二乘回歸（PLSR）來尋找化學成分（X變量）和活性（Y變量，即中性粒細胞回收率、巨噬細胞形成效率、巨噬細胞吞噬效率）之間的相關性。如圖4所示，20-hydroxylganoderic acid G、elfvingic acid A、elfvingic C、lucidenic acid I、 ganohainanic acid C等11個成分得分較高，可能為潛在的免疫活性成分，應進一步采用體內和體外實驗進行活性驗證和機制研究。

本文是以下論文的解析版，如需原文請看：

Zhenhao Li ，Yingqiu Shi ，Xiaohui Zhang ，Jing Xu， Hanbo Wang ， Lu Zhao  and Yi Wang，《Screening Immunoactive Compounds of Ganoderma lucidum Spores by Mass Spectrometry Molecular Networking Combined With in vivo Zebra?sh  Assays》，Frontier in Pharmacology，18 March 2020.